Tinción de Gram

Tinción de gram, fundamento de la técnica y diferencias entre las paredes celulares bacterianas.

La tinción de Gram es la más común de las tinciones utilizadas en bacteriología, está diseñada como una primera aproximación a la diferenciación bacteriana y permite dividir entre las bacterias que pueden retener el colorante violeta de genciana (cristal violeta) quedando de color azul intenso casi negro (grampositivas) y aquellas bacterias que no lo pueden retener por lo que se colorean de rosa o rojo (gramnegativas).

La técnica debe su nombre al bacteriólogo Christian Gram quien la desarrolló en 1884.

Mecanismo de la tinción de gram

Durante el proceso el cristal violeta (violeta de genciana) penetra a través de la pared celular en todas las células bacterianas, tanto grampositivas como gramnegativas. Luego se añade yodo (en forma de lugol) para formar un complejo con el colorante principal que aumente su fijación.

Durante la decoloración con etanol-acetona el complejo colorante-yodo queda retenido en las bacterias grampositivas mientras se pierde en las gramnegativas, estas últimas son coloreadas con safranina o fucsina para contrastarlas con las grampositivas

Procedimiento de la técnica (general e inespecífico).

1. Recoger muestras para ubicarlas en el microscopio.
2. Hacer el extendido con un palillo de madera.
3. Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
4. Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado tres veces aproximadamente).
5. Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un minuto.
6. Enjuagar con agua no directamente sobre la muestra
7. Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente.
8. Agregar alcohol o acetona y esperar entre 5 y 30 segundos según la concentración del reactivo (parte crítica de la coloración). (las gram - se decoloran, las gram + no)
9. Enjuagar con agua.
10. Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar un minuto. Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias gram negativas.
11. Lavar levemente con agua.

Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.

Pared celular de las bacterias grampositivas

Es bastante más gruesa que las de las células gramnegativas y está constituida principalmente por peptidoglicano (mureína), conteniendo también gran cantidad de ácidos teicoicos, polímeros de glicerol y ribitol, mientras aminoácidos como la d-alanina o azúcares como la glucosa están unidos a los grupos glicerol y ribitol.Tiene menos enlaces (es más simple) y poros más grandes.

Microbiologia Prescott 5ta ed.

Pared celular de las bacterias gramnegativas

Es bastante más compleja que las de las células grampositivas. Contiene dos capas situadas en el exterior de la membrana citoplasmática, inmediatamente después de esta encontramos que en primer lugar se encuentra una delgada capa de peptidoglicano que representa entre un 5% y un 10% del peso de la pared celular, y que además no contiene ácidos teicoicos. Seguidamente se encuentra la membrana externa, la cual es exclusiva de las células gramnegativas, y está conformada por una bicapa lipídica donde la parte interna esta constituida por fosfolípidos y la externa por lipopolisacáridos (LPS).